肯塔基大學研究利用納米孔長讀長測序技術分析阿茲海默症患者腦樣本中的RNA異構體

紐約——來自肯塔基大學及其合作夥伴的研究人員利用納米孔長讀長測序技術，對阿茲海默症患者腦樣本中的RNA異構體進行了定量和表徵。

這項研究上個月發表在《自然生物技術》雜誌上，研究人員以高置信度鑑定了數百種新的RNA異構體，包括由醫學相關基因生成的異構體，為研究這些異構體與腦部疾病病因的可能關聯提供了窗口。

RNA異構體來自同一基因但序列不同，它們通過選擇性剪接和內含子保留等機制，使基因多樣化其蛋白質編碼能力。

該研究的目的是展示長讀長測序在阿茲海默症RNA異構體分析中的價值，肯塔基大學教授、該論文的通訊作者馬克·埃伯特說。

埃伯特解釋說，由於短讀長測序的固有局限性，技術上幾乎無法準確區分同一基因的不同異構體。相比之下，長讀長測序有潛力一次性分析整個RNA異構體，提供了直接研究這些分子的途徑。

在他們的研究中，肯塔基大學的研究人員對12個老年人冰凍的死後大腦額葉皮層樣本進行了深度長讀長測序，包括6個阿茲海默症病例和6個認知未受損的對照樣本。所有樣本均來自歐洲血統的個體，並在疾病組和對照組中分別有男性和女性。

在RNA提取和樣本處理後，他們在Oxford Nanopore Technologies的PromethIon設備上使用每個樣本一個流動細胞進行測序，每個樣本產生了中位數為3550萬的比對讀數。“關鍵是首先獲得超純的RNA，這需要大量優化，”埃伯特實驗室的研究員、該研究的共同第一作者傑森·布蘭登說。

隨後，研究人員使用之前描述的軟件Bambu進行RNA異構體的鑑定和定量分析。

總體而言，研究人員調查了5035個與腦部疾病相關的醫學基因。在這些基因中，他們發現1917個基因表達了多個異構體，1018個基因在單一組織中生成了不同的蛋白質編碼序列異構體，展示了醫學相關基因中異構體的多樣性。此外，在這1018個基因中，有57個基因與神經系統疾病有關，包括重度抑鬱症、精神分裂症、帕金森病和阿茲海默症，作者指出。

研究人員還試圖在人體額葉皮層中鑑定和定量新的RNA異構體。他們報告了428種在該組織中的“高置信度”新異構體，其中53種來自49個醫學相關基因。“我們在報告異構體時非常保守，”埃伯特說，團隊在分析中設定了嚴格的截止標準以防止假陽性結果。

此外，該研究還發現了五種線粒體編碼的RNA異構體，展示了線粒體RNA中的選擇性剪接事件。其中，四種異構體跨越MT-RNR2轉錄本，編碼線粒體16S rRNA，而第五種異構體則跨越MT-ND1和MT-ND2基因。

除了已知基因外，該研究還調查了所謂的新基因體——基因組中尚未註釋的轉錄區域的RNA異構體，並發現了267種來自這些區域的高置信度新異構體。

“如果你不知道某物是否存在，你就無法衡量它並了解它是否影響疾病，”埃伯特實驗室的博士生、研究的另一位共同第一作者貝爾納多·阿古佐利·赫貝爾說。“通過揭示這些東西，我們可以開始了解它們是否在疾病中起作用。”

此外，研究人員還對樣本進行了差異異構體表達分析，揭示了阿茲海默症病例與對照組之間的99種差異表達的RNA異構體，儘管這些異構體背後的基因並沒有差異表達。

雖然數據集不足以得出具體的疾病結論，但研究作者指出，這些數據揭示了RNA異構體在疾病病因學中的潛在生物學功能，並呼籲進行更大規模的研究和進一步驗證。

“這是極少數比較患者和對照樣本以顯示異構體差異的研究之一，”密歇根大學計算醫學和生物信息學教授、未參與研究的歐金輝說。歐指出，儘管先前的研究已在實驗室樣本（如細胞系或小鼠模型）中探索了RNA異構體，但這項研究通過研究真實的人類疾病組織為該領域增添了巨大價值。

此外，歐強調了團隊在高深度測序樣本時設置嚴格參數以確保新RNA異構體的有效性的努力。“在基礎研究中，我們想要大量的發現，但在某些臨床或生物醫學研究應用中，你需要一個非常可靠的目標清單，”歐指出。“這是該論文向社區傳達的另一個重要信息。”

埃伯特表示，這項最新的原理驗證研究為目前正在進行的更大規模的研究奠定了基礎，旨在驗證300個樣本中的結果，包括阿茲海默症和對照組。

此外，考慮到當前研究使用的是Oxford Nanopore的舊版R9.4.1流動細胞，埃伯特表示，團隊還將採用新版R10流動細胞和Kit 14化學試劑進行新實驗。

最終，埃伯特指出，團隊的目標是利用異構體作為早期診斷和治療人類疾病的可靠生物標誌物。

“我們希望合法地識別出至少與阿茲海默症相關的RNA異構體，能夠作為生物標誌物，並希望朝著開發出無症狀疾病診斷邁進，”他說。