肯塔基大学研究利用纳米孔长读长测序技术分析阿尔茨海默症患者脑样本中的RNA异构体

纽约——来自肯塔基大学及其合作伙伴的研究人员利用纳米孔长读长测序技术，对阿尔茨海默症患者脑样本中的RNA异构体进行了定量和表征。

这项研究上个月发表在《自然生物技术》杂志上，研究人员以高置信度鉴定了数百种新的RNA异构体，包括由医学相关基因生成的异构体，为研究这些异构体与脑部疾病病因的可能关联提供了窗口。

RNA异构体来自同一基因但序列不同，它们通过选择性剪接和内含子保留等机制，使基因多样化其蛋白质编码能力。

该研究的目的是展示长读长测序在阿尔茨海默症RNA异构体分析中的价值，肯塔基大学教授、该论文的通讯作者马克·埃伯特说。

埃伯特解释说，由于短读长测序的固有局限性，技术上几乎无法准确区分同一基因的不同异构体。相比之下，长读长测序有潜力一次性分析整个RNA异构体，提供了直接研究这些分子的途径。

在他们的研究中，肯塔基大学的研究人员对12个老年人冰冻的死后大脑额叶皮层样本进行了深度长读长测序，包括6个阿尔茨海默症病例和6个认知未受损的对照样本。所有样本均来自欧洲血统的个体，并在疾病组和对照组中分别有男性和女性。

在RNA提取和样本处理后，他们在Oxford Nanopore Technologies的PromethIon设备上使用每个样本一个流动细胞进行测序，每个样本产生了中位数为3550万的比对读数。“关键是首先获得超纯的RNA，这需要大量优化，”埃伯特实验室的研究员、该研究的共同第一作者杰森·布兰登说。

随后，研究人员使用之前描述的软件Bambu进行RNA异构体的鉴定和定量分析。

总体而言，研究人员调查了5035个与脑部疾病相关的医学基因。在这些基因中，他们发现1917个基因表达了多个异构体，1018个基因在单一组织中生成了不同的蛋白质编码序列异构体，展示了医学相关基因中异构体的多样性。此外，在这1018个基因中，有57个基因与神经系统疾病有关，包括重度抑郁症、精神分裂症、帕金森病和阿尔茨海默症，作者指出。

研究人员还试图在人体额叶皮层中鉴定和定量新的RNA异构体。他们报告了428种在该组织中的“高置信度”新异构体，其中53种来自49个医学相关基因。“我们在报告异构体时非常保守，”埃伯特说，团队在分析中设定了严格的截止标准以防止假阳性结果。

此外，该研究还发现了五种线粒体编码的RNA异构体，展示了线粒体RNA中的选择性剪接事件。其中，四种异构体跨越MT-RNR2转录本，编码线粒体16S rRNA，而第五种异构体则跨越MT-ND1和MT-ND2基因。

除了已知基因外，该研究还调查了所谓的新基因体——基因组中尚未注释的转录区域的RNA异构体，并发现了267种来自这些区域的高置信度新异构体。

“如果你不知道某物是否存在，你就无法衡量它并了解它是否影响疾病，”埃伯特实验室的博士生、研究的另一位共同第一作者贝尔纳多·阿古佐利·赫贝尔说。“通过揭示这些东西，我们可以开始了解它们是否在疾病中起作用。”

此外，研究人员还对样本进行了差异异构体表达分析，揭示了阿尔茨海默症病例与对照组之间的99种差异表达的RNA异构体，尽管这些异构体背后的基因并没有差异表达。

虽然数据集“不足以得出具体的疾病结论，”研究作者指出，这些数据揭示了RNA异构体在疾病病因学中的潜在生物学功能，并呼吁进行更大规模的研究和进一步验证。

“这是极少数比较患者和对照样本以显示异构体差异的研究之一，”密歇根大学计算医学和生物信息学教授、未参与研究的欧金辉说。欧指出，尽管先前的研究已在实验室样本（如细胞系或小鼠模型）中探索了RNA异构体，但这项研究通过研究真实的人类疾病组织为该领域增添了巨大价值。

此外，欧强调了团队在高深度测序样本时设置严格参数以确保新RNA异构体的有效性的努力。“在基础研究中，我们想要大量的发现，但在某些临床或生物医学研究应用中，你需要一个非常可靠的目标清单，”欧指出。“这是该论文向社区传达的另一个重要信息。”

埃伯特表示，这项最新的原理验证研究为目前正在进行的更大规模的研究奠定了基础，旨在验证300个样本中的结果，包括阿尔茨海默症和对照组。

此外，考虑到当前研究使用的是Oxford Nanopore的旧版R9.4.1流动细胞，埃伯特表示，团队还将采用新版R10流动细胞和Kit 14化学试剂进行新实验。

最终，埃伯特指出，团队的目标是利用异构体作为早期诊断和治疗人类疾病的可靠生物标志物。

“我们希望合法地识别出至少与阿尔茨海默症相关的RNA异构体，能够作为生物标志物，并希望朝着开发出无症状疾病诊断迈进，”他说。